今天分享一篇澳洲莫纳什大学生殖健康中心Loveland博士课题组在《Human Reproduction》期刊上发表的WNT signalling in the normal human adult testis and in male germ cell neoplasms，影响因子为5.733分，属于中科院SCI 一区期刊。

doi:10.1093/humrep/deaa150

文章的关键术语
WNT signalling
spermatogenesis 精子发生
testicular germ cell tumor/TGCT睾丸生殖细胞瘤

研究主旨
本研究阐明了WNT信号通路在人睾丸中正常和肿瘤生殖细胞发挥的作用。这项研究采用了几种组织学方法，确立了参与WNT信号通路的蛋白在人睾丸中的表达定位图谱。同时Loveland博士课题组还鉴定出特定阶段和细胞类型是否直接受到WNT配体的影响。另外，该课题组还利用了TCam-2精原细胞瘤细胞系确定抑制信号通路的功能影响，以为筛选出治疗生殖细胞瘤的合适靶点。
WNT信号通路调控着各种生命活动的过程，包括生殖细胞生长发育。在肿瘤发生发展中，WNT信号通路的改变也发挥着一定作用，但目前尚未明确TGCT里WNT通路的成分和功能。
研究思路
该课题组在组织、细胞、分子水平上通过免疫组化、原位杂交、PCR和细胞活力检测都做了验证，而且文章能吸引读者，原创性高，所以最终能发表在5.733分期刊上。

1. 得到病人的知情同意后，收集睾丸癌组织样本以及正常睾丸组织样本，做石蜡包埋切片。
2. 利用TCam-2和SW480细胞系进行体外细胞培养。
3. 反转录PCR得到CTNNB1和AXIN2的cDNA后，转导入DH5α细菌细胞，用菌落PCR筛选和测序进行验证。之后，制备好的石蜡切片用蛋白酶K处理，接着用cRNA探针做原位杂交。
4. 从TCam-2细胞、SW480细胞和受精后12.5天的小鼠胚胎中分离出RNA，接着做Northern blot分析。
5. 在正常睾丸组织和睾丸癌组织切片上做免疫组化分析，检测CTNNB1、TCF7L1、TCF7L2。
6. 细胞爬片和免疫荧光分析，检测CTNNB1、TCF7L1、TCF7L2在TCam-2细胞的表达定位分布。
7. siRNA实验：接种培养TCam-2细胞后，用RNAiMAX系统做转染，siRNA结合于TCF7L1和TCF7L2并转染到TCam-2细胞中。未处理的TCam-2细胞和阴性对照siRNA作为对照。转染后1、3、5天后收集TCam-2细胞进行RNA分析。再用qRT-PCR做基因敲除鉴定。
8. qRT-PCR实验：从TCam-2细胞中分离RNA，反转录成cDNA，然后上样跑PCR。
9. 细胞数量和细胞活力检测
10. 细胞迁移实验

研究结果
在正常人睾丸切片上做原位杂交检测WNT通路的CTNNB1和AXIN2的定位情况，发现典型的WNT通路在生精细胞中较为活跃。

免疫组化法检测睾丸生殖细胞瘤GCNIS切片上的WNT通路的信号分子CTNNB1、WNT3A、TCF-1、TCF7L1、TCF7L2的表达定位分布情况，发现CTNNB1蛋白主要存在于GCNIS的细胞质和支持细胞里，WNT3A则在支持细胞里表达量很少，但主要表达在生精小管周围的间质区域内。TCF-1在GCNIS细胞核内和支持细胞都有表达。TCF7L1和TCF7L2只表达在GCNIS细胞核内。


免疫组化检测精原细胞瘤上WNT通路信号分子的定位分布情况，发现了CTNNB1分布在细胞浆内。WNT3A分布在周围细胞之间，似乎表明了免疫浸润现象的出现。





这图表明了TCam-2细胞能够受WNT的刺激而作出反应，则会快速把CTNNB1在核内积累到一定程度。



以下这图表明了WNT拮抗剂显著影响了TCam-2细胞的生长发育和迁移，TCam-2对WNT拮抗剂主要作用在通路的两个特定位点：IWR-1（破坏复合体的稳定性增加）以及CCT036477（抑制CTNNB1-TCF/LEF之间的相互作用）。


这图显示了抑制WNT信号通路能抑制TCam-2细胞的迁移，但当在5%血清培养时未必影响其细胞数量。



这图表明了抑制TCam-2细胞内TCF7L1和TCF7L2的抑制会导致迁移能力的下降。



终上所述，这项研究提供了新的证据，表明WNT信号通路在正常的精子发生过程中保持活跃的状态，也在生殖细胞瘤内呈现出相关性。抑制生殖细胞瘤内的WNT通路会减弱细胞生存能力和迁移力，这可为日后使用小分子（siRNA）抑制剂作为治疗转移性TGCT提供有力的证据。

以上图片均来源于https://doi.org/10.1093/humrep/deaa150