作为科研工作者，梦寐以求的事儿就是发高分文章，但由于种种原因，往往都只能是当个旁观者。。其实高分并不可怕（当然是得有基金的支撑），难的是思路和方法。。今天小博带大家一起解析一篇关于高通量测序的高分文章。

文章来自于《Gut》期刊的“Enteric fungal microbiota dysbiosis and ecological alterations in colorectal cancer”，影响因子高达17.016。

闲话不多说，直接进入正题——实验方案设计：

是不是感觉“太简单”，也许好多人心里想“这个我也可以做啊”等等，但是为什么作者能发高分文章，而我们却不行呢。。接下来小博带领大家进入正文，深度解析这篇文章。

1、首先一点比较重要的就是样本量（如果样本量太少，则随机性太大），本文作者分析来自中国香港的585名个体的粪便基因组序列，其中包括来自184名CRC患者、197名患有结肠腺瘤的患者和204名对照受试者（其中又分为：发现队列：73名CRC患者和92名对照受试者、独立中国验证队列V1： 111名CRC患者，197名腺瘤患者和112名来自香港的对照组）

注：样本中的Chinese cohort 1和Chinese cohort 2为来自香港的健康对照组、结肠直癌患者以及结肠腺瘤患者；German and French样本来自参考文献[1]，用来与本文的结果对比。

参考文献：[1] Zeller G, Tap J, Voigt AY, et al. Potential of fecal microbiota for early-stage detection of colorectal cancer. Mol Syst Biol 2014;10:766.

2、首先作者检测了结肠直癌（CRC）患者肠道微生物的群落结构组成和微生物多样性。

在discovery cohort中包括92个健康人群和73个CRC患者，PCA分析和RDA分析均显示CRC患者和健康人群肠道微生物明显区分为两个不同的组，表明CRC显示出独特的真菌谱。有趣的是，RDA分析还揭示了不同时期的CRC患者（TNM I/II期和TNM III/IV期）和健康对照组的肠道真菌明显聚为不同的簇，表明不同时期CRC患者肠道微生物内稳态特异性破环。然而，通过物种丰富度（Richness）和香浓指数（Shannon）发现CRC患者和对照组之间没有显著差异。综上表明肠道真菌组成的变化与结肠直癌发生有关。

3、接下来分析了CRC中肠道真菌的分类学改变。

在真菌分类群中，子囊菌门（Ascomycota）在真菌群中占主导地位，而担子菌门（Basidiomycota）在CRC患者组和对照组中均被观察为第二丰富的门。此外，反映真菌生态失调的担子菌/子囊菌比率在CRC中比对照更高。在较低的分类学水平上观察到另外的差异，与对照相比，CRC中的Saccharomycetes和 Pneumocystidomycetes纲的显着降低，而Malasseziomycetes显著富集。在科（family）层面，Lipomycetaceae在CRC中显着减少，而Pisolithaceae、Marasmiaceae、Malasseziaceae、Erysiphaceae、Pseudorotiaceae和Chaetomicaeae增加。此外，在属（genus）的水平上，CRC富含六种真菌特征，包括 Malassezia、Moniliophthtora、Rhodotorula、Acremonium、Thielaviopsis和Pisolithus。

4、接下来作者分析了“真菌物种作为CRC诊断标志物”，为CRC的诊断治疗提供依据。

为了鉴定具有CRC诊断潜在价值的肠道真菌分类群，作者研究了物种水平的真菌改变。在对比混杂因素（即年龄，性别和BMI）进行校正后，与对照组相比，观察到38种真菌物种的丰度在CRC患者中显着不同。其中CRC患者中29种真菌富集，而其他9种则降低。具有超过两倍丰度变化的物种具有较好的诊断潜力，包括Aspergillus flavus、Kwoniella mangrovensis、Pseudogymnoascus sp.VKM F-4518、Debaryomyces fabryi、A.sydowii、Moniliophthora perniciosa、K.heavenensis、A.ochraceoroseus、Talaromyces islandicus、Malassezia globosa、Pseudogymnoascus sp.VKM F-4520、A.rambellii、Pneumocystis murina和Nosemia apis。作者观察到这些标记物将CRC和对照组区分开，AUC为0.93。他们还将对照与早期CRC区分开来，AUC为0.91。

注：AUC（Area Under the Curve），即曲线下的面积。Control：n=92；CRC：n=73（early_CRC, n=20），AUC值越高，表明诊断效果越好。

一般来说，菌群多样性、结构组成以及CRC患者的潜在的诊断标志微生物分析，讲到这里也就差不多了，但这就是我们为何会受限于低分的原因。作者接下来的分析才是亮点。

5、作者进一步验证了独立队列中CRC的粪便真菌诊断标志物。

在discovery cohort群组中鉴定的真菌分类表型在独立的中国队列V1（Chinese cohort V1）中进行了研究，其包括112个对照，197个结肠腺瘤和111个CRC受试者。有趣的是，前文中发现的真菌标志物明显地将对照组与CRC患者和早期CRC患者分层（AUC分别为0.82和0.81）。此外，真菌标志物在种族不同的欧洲队列V2（German and French cohort V2）中得到验证，从中获得0.74和0.72的AUC分别用于CRC与对照和早期CRC与对照的比较。然而，真菌标记物只能将腺瘤患者与对照组进行分类，AUC在队列V1和V2中分别为0.63和0.6。

6、最后，作者分析了CRC中的生态网络以及探讨了科水平上差异丰富的细菌和真菌之间的生态相互作用。

由于CRC的复杂性和多因素性，作者通过估计真菌内部和细菌-真菌间的相关性来研究结肠直肠肿瘤中多种微生物生态相互作用的潜在变化。作者在真菌界网络中观察到相当大的差异，在CRC中具有更多的正相关和更强的相互作用。此外，在CRC和对照之间观察到明显不同的交互生态网络。真菌和细菌之间的相关性在对照组中比在CRC中更少且大部分为正相关，其中观察到更多且更强的共排斥关系。在对照中，发现子囊菌门与细菌变形菌门的Alpha-、Gamma-、Delta-和Betaproteobacteria协同相关。相反，观察到担子菌和粘多糖门的其他真菌纲参与CRC中的新的互作关系，即与主要细菌类别（包括Alpha-、Gamma、Deltaproteobacteria和Cytophagia）形成显著的共排斥网络。与对照组相比，CRC中增强的真菌内共生和细菌—真菌共排斥相关网络在组群V1（Chinese cohort）和V2（German and French cohort）中进一步得到验证。总之，这些结果表明肠道中的真菌和细菌之间存在复杂的关系，其中它们的拮抗作用可能有助于结肠直肠肿瘤发生。

除此之外，为了理解CRC和对照中差异丰富的细菌和真菌之间的潜在相互作用，作者进行了细菌差异丰度分析并在科水平（family level）评估了生态网络。在对照中，观察到真菌Chaetomiaceae和细菌Ruminicoccaceae之间以及真菌Pseudeurotiaceae和细菌Alteromonadaceae和Geobacteraceae之间的共现相互作用，其反映了跨界的协同相互作用对结肠微生物群稳态的贡献。然而，在CRC中，随着细菌Geobacteraceae、Synergistaceae、Peptoniphilacea和Fusobacteriaceae的富集，CRC富集的真菌Chaetomiaceae和CRC降低的细菌Ruminicoccaceae之间，以及CRC富集的真菌Pseudeurotiaceae和CRC降低的细菌Alteromonadaceae之间的正相关性不再存在，但真菌Pseudeurotiaceae和细菌Geobacteriaceae之间的关系转变为负相关。此外，在富含CRC的细菌家族中，只有Geobacteraceae参与CRC中与真菌的共排斥关系。值得注意的是，作者的网络分析显示，在CRC中，降低的细菌科与富集的真菌科形成显着的共排斥相互作用，而富集的细菌科如Fusobacteriaceae，Synergistaceae和Peptoniphilaceae与富集或降低的真菌科没有显着相关。这表明，细菌界中的生态失调可能会增强CRC中某些真菌科的定植。另一方面，在真菌界中，与对照组相比，CRC中富集的真菌科之间形成了广泛的协同网络，包括Erysiphaceae、Malasseziaceae、Marasmiaceae、Pseudeurotiaceae、Chaetomiaceae和Pisolithaceae。特别是，观察到曲霉菌与所有CRC富集的真菌科具有相对强的正相关生态相互作用，这种现象在对照组中是不存在的。因此，分析表明跨界共生交互生态关系可能对健康肠道的肠道稳态具有重要意义，而生态失调可能为真菌界增强的正相关生态相互作用提供了一个合适的环境，而这又可以在结直肠癌发生中发挥作用。

这项研究揭示了CRC相关的真菌生物学失调，其特征是真菌组成和生态学改变，表明肠道真菌可能在CRC中发挥作用，为结肠直癌的诊断提供依据。

文中图片和信息均来源于文献：“Enteric fungal microbiota dysbiosis and ecological alterations in colorectal cancer.”

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